2 英文参考
toxoplasma[WS/T 486—2015 弓形虫病的诊断]
3 概述
弓形虫(toxoplasma)是一种寄生于人和动物体内的原虫,可寄生于人体几乎所有有核细胞内,因滋养体似弓形或半月形而被命名为弓形虫,可引起人体弓形虫感染或弓形虫病。[1]
弓形虫最早发现于刚地梳趾鼠(Ctenodactylus gondii)体内单核细胞中,是一种能寄生于人体几乎所有有核细胞内的原虫,猫科动物为其唯一终末宿主,其他哺乳动物、鸟类和人类都可为其中间宿主。其发育全过程有滋养体(包括速殖子和缓殖子)、包囊、裂殖体、配子体和卵囊等5种生活史阶段,临床上有诊断价值的为速殖子(假包囊)和包囊。[1]
4 弓形虫的形态
4.1 速殖子(假包囊)
速殖子(tachyzoite)呈香蕉形或半月形,前端较尖,后端较钝。长3μm~7μm,最宽处2μm~4μm。经Giemsa法染色后胞浆呈蓝色,胞核呈紫红色,位于虫体中央稍偏后。[1]
细胞内寄生的速殖子不断增殖,一般含数个至十多个,其被宿主细胞膜包绕的虫体集合体没有真正的囊壁,称为假包囊(pseudocyst)。[1]
4.2 包囊
包囊(cyst)呈圆形,具有由虫体分泌的一层富有弹性的坚韧囊壁,内含数十个至数千个缓殖子(bradyzoite)。缓殖子直径范围为5μm~100μm,多见于脑、骨骼肌、视网膜及其他组织内,可长期在组织内生存。[1]
5 弓形虫的生活史
在终宿主体内的发育过程:猫科动物吞食卵囊、包囊或假包囊后,在小肠内逸出子孢子、缓殖子或速殖子,侵入小肠上皮细胞发育增殖,形成裂殖体。裂殖体成熟后释出裂殖子,再侵入其他肠上皮细胞形成下一代裂殖体。经过数代后,部分裂殖子发育为雌、雄配子体,再继续发育为雌、雄配子。雌、雄配子受精成为合子,继续发育形成卵囊,从上皮细胞内逸出进入肠腔,随粪便排出体外。在25℃温度和适宜湿度环境条件下,经2 d~4 d发育为具有感染性的成熟卵囊。同时,弓形虫也可在猫科动物的肠外组织中进行无性增殖。[1]
在中间宿主体内的发育过程:当猫粪内的卵囊或动物肉类中的包囊或假包囊被人、羊、猪、牛等中间宿主吞食后,在肠内逸出子孢子、缓殖子或速殖子,侵入肠壁经血或淋巴液进入单核巨噬细胞内寄生,并扩散到全身各组织器官,如脑、眼、肝、心、肺、肌肉等,进入细胞内以二分裂或内芽生增殖形成假包囊,当细胞破裂后,速殖子侵入其他组织细胞。当机体免疫功能正常时,部分速殖子侵入宿主细胞,特别是脑、眼、骨骼肌等组织,虫体增殖速度减慢并分泌囊性物质形成包囊。包囊在宿主体内可存活数月、数年或更长时间。当机体免疫功能低下或缺陷时,可诱发包囊发育而破裂,释出缓殖子,进入血流并侵入其他组织细胞形成假包囊,继续发育增殖。[1]
6 弓形虫感染的流行病学
弓形虫是重要的机会性致病寄生虫,呈世界性分布,人群感染相当普遍,多属隐性感染。全国人畜弓形虫病调查研究协作组(1983年~1986年)采用IHA方法调查19个省(直辖市、自治区)141个县的81968名居民,结果血清弓形虫抗体阳性率为0.33%~11.79%,平均阳性率为5.16%。全国人体重要寄生虫病现状调查(2001年~2004年)报告,采用ELSA方法在15个省(直辖市、自治区)检测47444人,结果血清抗体阳性率为0.79%~16.810/,平均阳性率为7.88%,抗体阳性率随年龄增加呈上升趋势。[1]
6.1 传染源
随粪便排出弓形虫卵囊的猫科动物是最重要传染源,其次为感染弓形虫的其他哺乳动物、鸟类等温血动物。弓形虫可通过胎盘感染胎儿,故受感染的母亲也是传染源。[1]
6.2 传播途径
先天性弓形虫感染是指经母体胎盘感染胎儿;获得性弓形虫感染是指经人体消化道黏膜、损伤皮肤、输血、器官移植等途径传播。[1]
6.3 易感人群
人类对弓形虫普遍易感,尤其是胎儿、婴幼儿、饲养或接触猫犬等宠物者、动物饲养员、屠宰工以及各种免疫功能低下或缺陷者。[1]
6.4 流行因素
弓形虫卵囊在外界具有较强的抵抗力,寒带、温带、热带地区均有分布,没有严格的地理分布界线。人群感染弓形虫与饲养宠物、饮食习惯等有关。在食品加T过程中,如生熟不分造成交叉污染可增加弓形虫感染机会。[1]
7 弓形虫感染的临床表现
弓形虫感染有先天性和获得性两种途径。妇女在妊娠期感染弓形虫后多数可造成胎儿先天性感染,一般婴幼儿期常不出现明显临床症状和体征。当各种原因造成免疫功能低下时,儿童期可呈现中枢神经系统损害表现,成人期可出现视网膜脉络膜炎等。妇女妊娠初期感染弓形虫后少数可出现流产、早产、死产或畸形,妊娠中晚期感染弓形虫可造成胎儿出生后有脑、眼、肝、心、肺等部位的病变或畸形。[1]
免疫功能正常者获得性感染弓形虫后,多数不出现明显临床症状和体征,为隐性感染。当免疫功能低下或缺陷时,弓形虫可侵犯人体各个器官而引起相应严重临床表现,如弓形虫脑病、弓形虫眼病、弓形虫肝病、弓形虫心肌心包炎、弓形虫肺炎等。[1]
7.1 弓形虫感染
免疫功能正常者感染弓形虫后,包囊可长期寄生于中枢神经系统或横纹肌内,临床上多无明显症状和体征,仅弓形虫病原学检测阳性。[1]
7.2 弓形虫脑病
弓形虫脑病临床上表现为脑炎、脑膜炎、脑膜脑炎、癫痫、精神异常等,可出现头痛、眩晕、谵妄、肌痛、淋巴结肿大等,脑脊液中可查见弓形虫速殖子。[1]
7.3 弓形虫眼病
弓形虫眼病主要为复发性、局限性、坏死性视网膜脉络膜炎,临床上表现为视力模糊、眼痛、畏光、盲点和流泪等。眼底表现为后极部视网膜水肿,黄斑渗出性病灶。新鲜病灶边界模糊,青灰色,轻度隆起,周围有视网膜出血;陈旧性病灶为卫星状散在白色圆形斑块及色素斑,或黄斑部色素上皮脱落。[1]
7.4 弓形虫肝病
弓形虫破坏肝细胞引起肝实质炎症浸润和局部坏死,临床上表现为食欲减退、肝区疼痛、腹水、轻度黄疸、肝硬化、脾肿大等,病程长易复发。[1]
7.5 弓形虫心肌心包炎
弓形虫心肌心包炎临床上可出现发热、腹痛、扁桃体炎、眼睑浮肿等,常无明显心脏异常症状,也可出现心悸、颈静脉怒张、胸痛、呼吸困难等,偶可闻及心包摩擦音。重者可出现胸前或胸骨后钝痛、锐痛,疼痛向颈部和肩部放射,如不及时治疗可出现心力衰竭。[1]
7.6 弓形虫肺炎
临床上表现有咳嗽、咳痰、胸痛、气短、肺部哕音等,X线检查有炎症浸润灶。肺部病变多合并巨细胞病毒和细菌感染,呈间质性和小叶性肺炎表现。[1]
7.7 其他
妇女妊娠初期感染弓形虫可通过胎盘屏障,常使胎儿发生广泛病变而导致流产、早产、死产等,可见无脑儿、脑积水、小头畸形、小眼畸形、智力发育不全等,成为人类先天性感染中最为严重的疾病之一。[1]
8 弓形虫的实验室检查
8.1 弓形虫IgG抗体检测
8.1.1 方法
采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法,检测人血清、血浆或其他体液样品中弓形虫IgG抗体。
8.1.2 试剂组成
由弓形虫抗原包被的96微孔板、人葡萄球菌蛋白A(SPA)或抗人IgG酶标记物液、样本稀释液(含0.9%氯化钠的生理盐水)、洗涤液(含有Tween-20缓冲液)、终止液(主要成分为1 mol/L硫酸溶液)、阳性对照、阴性对照、底物A液(主要成分为过氧化脲)、底物B液(主要成分为四甲基联苯胺)组成。
8.1.3 操作步骤
在洁净试管中加入1 mL稀释液,然后加10μL待检样品液,混匀。每孔中加入稀释的待检样品100μL,设阳性对照1孔,阴性对照2孔(每孔分别加阳性对照、阴性对照2滴),并设空白对照1孔,置37℃孵育30 min。随后弃去孔中液体,用洗涤液洗涤5次,每次间隔1 min,甩干。除空白对照孔外,每孔加入1: 50稀释的酶标记物液50μL(即1 mL稀释液中加入酶结合物20μL),37℃孵育30 min。随后弃去孔中液体,用洗涤液洗涤5次,每次间隔1 min,甩干。每孔先后加底物A液、底物B液各1滴,轻叩反应板使之混匀,室温避光放置5 min~10 min。每孔加终止液1滴。
8.1.4 结果判定
采用比色计数法,以空白孔调零,用酶标仪测定各孔450 nm波长OD值。如S/N(样品孔OD值/阴性对照孔OD均值)≥2.1,结果判为阳性。
8.2 弓形虫IgM抗体检测
8.2.1 方法
采用抗体捕捉ELISA法,检测人血清、血浆或其他体液样品中弓形虫IgM抗体。
8.2.2 试剂组成
由抗人IgM-μ链抗体包被的96微孔板、弓形虫抗原液、抗弓形虫抗体酶标记物液、样本稀释液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照、底物A液、底物B液组成。
8.2.3 操作步骤
每孔中加稀释液90μL,然后加待检样品液10μL,充分混匀,设阳性对照1孔,阴性对照2孔(每孔分别加阳性对照、阴性对照2滴),并设空白对照1孔,置37℃孵育30 min。随后弃去孔中之液体,用洗涤液洗涤5次,每次间隔1 min,甩干。除空白对照孔外,每孔先加入抗原液1滴,随后加1: 50稀释的酶标记物液50μL(即1 mL稀释液中加入酶结合物20μL),轻叩反应板使之混匀,37℃孵育30 min。随后弃去孔中之液体,用洗涤液洗涤5次,每次间隔1min,甩干。每孔先后加底物A液、底物B液各1滴,轻叩反应板,室温避光放置10 min~20 min。每孔加终止液1滴。
8.2.4 结果判定
采用比色计数法,以空白孔调零,用酶标仪测定各孔450 nm波长()D值。如S/N(样品孔OD值/阴性对照孔OD均值)≥2.1,结果判为阳性。
8.3 弓形虫IgG抗体和IgM抗体的临床意义与处理方法
弓形虫抗体检测是目前最主要的辅助检查方法,通常需联合进行IgG和IgM抗体平行检测,弓形虫血清学抗体检测结果的临床意义见表D.1。怀疑孕妇近期感染,采取干预措施之前应将标本送至有诊断弓形虫病经验的实验室比对。
8.4 弓形虫CAg检测
8.4.1 方法
8.4.2 试剂组成
由纯化抗弓形虫特异性抗体(多抗)包被的96微孔板、抗弓形虫特异性抗体酶标记物液、样本稀释
液、洗涤液、终止液、阳性对照、阴性对照、底物A液、底物B液组成。
8.4.3 操作步骤
每孔中加稀释液40μL,,然后加待测样品液10μL,充分混匀,并设阳性对照1孔,阴性对照1孔、空白对照1孔(每孔分别加阳性对照、阴性对照、稀释液各1滴)。除空白对照外,各孔随后加稀释的酶标记物液50μL,轻叩反应板使之混匀,置37℃孵育1 h。随后弃去孔中之液体,用稀释液洗涤5次,每次间隔1 min,甩干。每孔先后加底物A液、底物B液各1滴,室温避光放置10 min~20 min。每孔加终止液1滴。
8.4.4 结果判定
采用比色计数法,以空白孔调零,用酶标仪测定各孔450 nm波长OD值。如S/N(样品孔OD值/阴性对照孔OD均值)≥2.1,结果判为阳性。
8.5 弓形虫核酸检测
8.5.1 方法
采用聚合酶链式反应(PCR)技术,从Bl基因和AF146527序列等选取靶基因,对弓形虫特异性DNA核酸片段进行荧光PCR检测。
8.5.2 试剂组成
由核酸抽提液、弓形虫核酸荧光PCR检测混合液、酶(Taq+UNG)、水(H2O)、内部对照品、阳性对照品组成。
8.5.3 操作步骤
首先进行标本、对照品的核酸裂解处理。如为血液或体液,取50μL样本,加50μL核酸提取液,振荡10 s,99℃干浴或水浴10 min,2500 g离心10 min,保留上清备用。如为粪便,挑取米粒大小粪便放置于含0.5 mL生理盐水的离心管中,振荡混匀,2500 g离心2 min,去尽上清,沉淀中直接加入100μL DNA提取液充分混匀,沸水浴10 min,2500 g离心5 min,取上清4V_L进行PCR反应,取水(H2O)作为阴性对照。然后进行试剂配制,取35μL弓形虫核酸荧光PCR检测混合液与1μL内部对照品,以及0.4μL酶(Taq+UNG),振荡混匀数秒,1358 g离心数秒。取上述混合液36μL置于PCR反应管,然后将已处理标本、阳性对照品、水(H2O)各4μL分别加入PCR反应管,盖好管盖,置于定量荧光PCR仪上,分别设置循环参数为37℃2 min、94℃2 min、93℃15 s、60℃60 s,四个参数循环40次。单点荧光检测在60℃,反应体系为40μL。荧光检测选用羧基荧光素(FAM)和六氯荧光素(HEX)通道,基线调整取6~15个循环的荧光信号,阈值设定原则以阈值线刚好超过水(H2O)检测荧光曲线的最高点。
8.5.4 结果判定
在FAM通道,当Ct(Crossing point)值≤38时,结果判为阳性。
8.6 病原学检查
8.6.1 直接镜检
取外周血或脑脊液、视网膜下渗出液、房水、胸水、腹水、羊水等待检血液或体液,500 g离心10 min,取沉淀液进行涂片,经干燥、固定和Giemsa法染色,光镜下如查到弓形虫速殖子(假包囊)则判为病原学阳性。
取活检组织,病理切片后经Giemsa法染色,光镜下如检测到弓形虫包囊或速殖子(假包囊)则判为病原学阳性。
8.6.2 动物接种
取外周血或脑脊液、视网膜下渗液、房水、胸水、腹水、羊水等待检血液或体液,无菌接种于6周~8周龄清洁级健康小鼠腹腔内,每只接种1mL。逐日观察,如接种2周~3周后如小鼠jLH现皮毛松竖、不活泼、弓背、闭目、腹部膨大、颤动或呼吸急促等症状,应立即剖杀。取小鼠腹腔液以及肝、脾、脑等组织,经研磨过滤500 g离心10 min后制成涂片,Giemsa法染色后镜检,如查到弓形虫速殖子(假包囊)或包囊则判为病原学阳性。
如首次接种结果为阴性或小鼠未发生死亡,无菌取其脑、肝、心、肺、淋巴结等组织各2 g,放入组织研钵中研磨成匀浆,加0.9%生理盐水配制成10%~20%的组织悬浮液,再次接种6周~8周龄清洁级健康小鼠腹腔内。小鼠盲传至少3代,每2周1次,如查到弓形虫则判为病原学阳性。
9 参考资料
- ^ [1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS/T 486—2015 弓形虫病的诊断[Z].2015-12-15.